От беременности к ковиду

Благодаря коронавирусу практически всем пришлось освоить азы иммунологии, научиться отличать тесты на антитела от тестов на антиген и разобраться, какой из них нужен в том или ином случае. Хотите узнать, есть ли в вас вирус? Выбирайте экспресс-тест на вирусный антиген или ПЦР. Не уверены, что болели и когда это было? Ответ даст экспресс-тест на антитела. А если нужно понять, как после ревакцинации изменился иммунитет, подойдет третий вариант — количественный тест на антитела. У трех из четырех перечисленных тестов разные задачи, но механизм работы один и тот же и основан на взаимодействии антител и антигенов. Он же используется и в массе других тестов, например на беременность. Вместе с «Авивир» разбираемся, как они работают.

Своим появлением вся группа ковидных тестов, кроме стоящего особняком ПЦР, у которого совершенно иной принцип работы, обязана бурному развитию иммунологии во второй половине ХХ века. Именно тогда были разработаны основные методы работы с антителами и намечены основные пути их использования в медицине.

В 1950-х годах уже было известно, что в нашем организме антитела вырабатываются B-лимфоцитами в ответ на появление чужеродных частиц-антигенов, умеют их узнавать и приклеиваются с невероятной избирательностью, делая заметными для остальной иммунной системы. Выяснилось также, что в качестве антигенов может выступать практически любая субстанция — бактериальные белки, чужеродные гормоны и даже антитела из других видов животных. Та же задача — найти в биоматериале конкретное вещество и пометить его — постоянно встречается в лабораторной практике. Сочетание специфичности и универсальности делало антитела отличными кандидатами на роль идеального маркера.

Первые шаги к лабораторному применению антител были сделаны в середине ХХ века, когда появился радиоиммунный анализ. Для выполнения этого теста требовались неразмеченный образец, некоторое количество искомого вещества, помеченного радиоактивной меткой, и антитела к нему. Все это смешивалось друг с другом, а затем антитела с приклеившимся к ним антигеном отделяли от общей взвеси. Если во взвеси оставалось много меток, это означало, что большинство антител «занято» веществом из образца. И наоборот, если вся радиоактивная метка уходила в антитела, это значило, что в образце нет ничего, что могло бы связаться с антителами.

Метод оказался очень точным и невероятно ценным — позже исследователям дали за него Нобелевскую премию. Тем не менее, использование радиоактивной метки было опасным для здоровья, и ей пришлось искать замену. Сделать это удалось в начале 1970-х: две независимые группы шведских и голландских ученых предложили использовать для этого цветные ферментативные реакции.

Сигнальные ферменты

Некоторые ферменты катализируют реакции, в которых их субстрат меняет цвет. Именно такие ферменты исследователи и решили пришить к антителам. Одним хвостом такой гибрид должен «узнавать» закрепленный на целлюлозе антиген, а другим — после добавления ферментативного субстрата — сигнализировать о своем присутствии ученым. Не связавшиеся с антигеном гибриды можно было просто смыть, чтобы сигнал от них не поступал.

Шведская версия иммуноферментного анализа (ИФА) — так назвали новую технологию — была сделана для поиска кроличьих иммуноглобулинов. Вообще-то, иммуноглобулины — это и есть антитела. Но если вакцинировать ими другое животное, например овцу, они могут выступать и в роли антигенов. Овечий иммунитет будет считать кроличьи иммуноглобулины инородными и подберет собственные антитела, которые будут ловить только иммуноглобулины кроликов и больше ничего.

Имея на руках кроличьи иммуноглобулины и овечьи антитела, ученые сконструировали сам тест. Овечьи антитела закрепили на целлюлозе, а к кроличьим пришили щелочную фосфатазу, которая умела перерабатывать бесцветный субстрат в продукт желтого цвета. К тому моменту все подготовительные стадии (сшивка с ферментом, иммобилизация антител) уже были опубликованы. Исследователям оставалось лишь собрать все воедино и удостовериться, что из-за сшивки ни фермент, ни антитело не утратили своих функций.

Несмотря на то что дееспособность таких гибридов подвергалась сомнению, они отлично сработали. Сшитые с фосфатазой кроличьи иммуноглобулины цеплялись за овечьи, закрепленные на целлюлозе, и потом при добавлении ферментативного субстрата меняли его цвет.

Голландцы сделали практически то же самое, но взяли вместо фосфатазы пероксидазу хрена, а на роль искомого антигена выбрали хорионический гонадотропный гормон человека (ХГЧ). Кроме того, в своей статье они крайне лаконично описали практическое значение работы, упомянув лишь, что тест можно проводить на образцах мочи. На деле это означало, что придуманная ими реакция может быть использована в тестах на беременность.

Проще, быстрее, доступнее

Технология, придуманная голландцами, не подразумевала домашнего использования, но обладала рядом преимуществ. Например, она не требовала присутствия цельных клеток и давала быстрый количественный, а не качественный результат. Детекция результата по цвету раствора оказалась проще и могла быть автоматизирована.

ИФА оказался настолько перспективным, что «допиливать» эту технологию и искать ей применение кинулись многие. Буквально за десять лет она стала одной из самых востребованных в иммунологии. Параллельно с ней появились и другие методы, которые существенно упростили ее применение.

Прежде всего, в обиход исследователей вошли полистирольные микропланшеты. Свойство белков (и, в частности, иммуноглобулинов) цепляться к поверхности полистирола и его модификаций было открыто в 1960-е годы, а появление планшетов с 96 лунками для анализов позволило упростить и частично автоматизировать методику.

Модификации ИФА позволили сильно упростить само тестирование. Одним из тормозящих звеньев была необходимость придумывать для каждого нового антигена сшивку с ферментом. Кроме того, для каждого нового образца приходилось этот фермент пришивать заново и тратить на это время. Чтобы избавиться от этой необходимости, был придуман так называемый «сэндвич ИФА», где антиген зажимается между двумя специфичными к нему антителами. Первое удерживает всю конструкцию на поверхности, а второе служит посадочной площадкой для универсального «красящего» антитела с пришитым ферментом. Благодаря этому подготовка эксперимента для совершенно нового антигена свелась к получению из животных специфичных антител, а для окраски можно было использовать универсальные антитела с ферментом. Кроме того, эта вариация оказалась точнее и позволила обнаруживать даже небольшие концентрации антигена.

Такой вариант ИФА позволяет аккуратно определить количество нужного вещества в образце за сравнительно короткое время. Если же искомое вещество само по себе является антителом, то схема меняется в соответствии с запросом: теперь уже антитела ловят на приманку из антигенов. Именно такой вариант используется, когда нужно определить уровень антител к конкретному белку коронавируса. Он выполняется в лаборатории и требует времени.

Работа на скорость

Но часто важными оказываются не количественные подсчеты, а скорость — как, например в случае с тестом на беременность или экспресс-тестами на ковид. Как уже говорилось, первые ИФА-тесты предназначались совсем не для домашнего применения. Потребовалось полтора десятка лет, чтобы привести их к привычному виду полосок, готовых выдать результат за несколько минут.

Проточная организация этих тестов позволила уйти от бесконечных промываний лунок: благодаря адсорбционным свойствам наполнителя молекулы антигенов протекают из одного конца полоски в другой по очереди, встречаясь с разложенными реагентами и цепляя их на себя.

Вместо ферментативной реакции сейчас часто используют другие красители, например кусочки латекса или золотые наночастицы. Однако суть теста от этого не меняется. Если перепутать и добавить образец с другой стороны полоски, тест не сработает — гибридные антитела будут двигаться в противоположном направлении. В этом случае тест не покажет ни положительной, ни контрольной полосы.

А это точно?

Точность теста сильно зависит от того, как именно подобрана пара антиген — гибридное антитело. В случае ХГЧ найти оптимальные антитела легко, ведь ХГЧ у всех одинаковый. Но если это тест на коронавирус со множеством штаммов, задача становится нетривиальной.

В этом случае разработчики стараются подобрать антитела с наиболее широким покрытием, узнающие самые консервативные участки белков. В то же время выбранные антитела должны игнорировать белки сезонных коронавирусов, которые в противном случае дают ложноположительный результат. Способность антител узнавать разные штаммы варьируется от производителя к производителю — это значит, что и результаты тестов могут оказаться не консистентны.

Обратный экспресс-тест, тест на антитела, имеет все те же проблемы с балансом точности, а также дополнительные нюансы. Использовать его имеет смысл в ситуациях, когда нужно быстро распознать позднюю стадию ковида или удостовериться, что человек болел или прививался. При позднем ковиде организм вырабатывает антитела класса IgM, а во время выздоровления и после него — антитела класса IgG. Продвинутые экспресс-тесты улавливают эту разницу.

В качестве крючка-антигена, на который будут ловиться антитела, обычно берут RBD — домен спайк-белка. Это не самый консервативный участок вируса, но антитела, которые на него ловятся, особенно важны для борьбы с ковидом. Блокируя этот домен, они препятствуют попаданию вируса в клетку и тем самым нейтрализуют его. Строго говоря, способность антител к нейтрализации нужно каждый раз проверять в отдельном эксперименте, но в целом антитела именно к этому домену имеют больше всего шансов помешать вирусу заразить клетку.

Но не всем разработчикам удается подобрать нужные параметры для тестов. Так, например FDA предостерегает от использования экспресс-тестов на коронавирус Lepu Medical Technology и антительных тестов Leccurate — слишком много они выдают ложных результатов.

Сравнение результатов семи коммерческих тестов на коронавирус показало, что в зависимости от концентрации коронавирусных белков в образце они ловят их с разной чувствительностью. В исследовании участвовали обычные больные без секвенирования вируса, так что мы не можем узнать, какие именно штаммы были целью проверки. Если некоторые образцы без проблем узнавались практически всеми тестами, то с другими срабатывали не все.

Возможно, дело как раз в специфичности тестов к разным вариантам вируса. Например, для теста RapiGEN потребовались концентрации примерно в 1000 раз больше, чем для других тестов. Некоторое время назад озвучивались сомнения в том, что подобные тесты не реагируют на сезонные коронавирусы. В этом исследовании оказалось, что все семь достаточно специфичны. Поэтому беспокоиться о том, что результаты окажутся ложноположительными, по крайней мере для этих тестов, не стоит.

Вера Мухина